转录组差异分析及可视化 | 三大R包对比 （DEseq2 、edgeR、limma ）
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枫以
2025-06-20 09:17:37
在高通量测序领域，差异分析是关键步骤，通常基于原始count矩阵进行，而不是TPM、FPKM标准化后的矩阵，因为它们各自有相应的标准化方法。对于此过程，常用到三大R包：DEseq2、edgeR以及limma。
我们先要理解，原始的count矩阵通常由RSEM生成，而DESeq2不支持小数点的存在，因此需要对矩阵进行取整处理。
在处理数据时，我们经常遇到的问题是如何处理非标准的count矩阵，如由RSEM生成的数据。对此，limma作者给出了建议，使用limma-voom更为合适。对于DESeq2，最佳做法是使用tximport进行转换或对矩阵进行取整后使用DESeqDataSetFromMatrix。
下面，让我们分步骤深入探讨使用DESeq2、edgeR以及limma进行差异分析的具体操作：
1. **读取矩阵**：加载数据集，准备进行后续分析。
2. **数据预处理**：除去低表达基因并进行取整操作，以满足不同工具的输入需求。
3. **构建分析对象**：设置分组信息，构建相应的数据结构（dds）。
4. **差异分析**：使用DESeq函数估计离散度，然后执行差异表达分析。
5. **结果提取**：从差异分析结果中筛选差异表达基因，并标记它们的上调或下调状态。
接下来，我们转向使用edgeR进行差异分析：
1. **估计dispersion**：对数据进行dispersion估计，以评估不同基因的变异性。
2. **可视化**：利用plotBCV展示不同表达量基因与模型拟合的情况，以判断模型的适应性。
3. **差异分析与结果提取**：执行差异表达分析并提取差异表达矩阵，标记基因的上调或下调状态。
最后，我们使用limma进行差异分析，操作流程与DESeq2和edgeR相似，但具体步骤可能有所不同。
在比较这三大R包的性能时，我们可以关注以下方面：
- **差异基因的数量**：每个工具得到的上调和下调基因的差异。
- **维恩图分析**：展示三个工具差异基因的交集与差异。
- **可视化**：通过火山图和热图直观展示差异基因的统计意义和表达趋势。
- **总结**：综合评估它们在不同场景下的表现，选择最适合特定研究需求的工具。
不同R包在处理高通量测序数据时各有优势，选择合适的工具取决于具体需求、数据特性和研究目的。在实践中，对差异分析软件的性能进行评估和比较是非常重要的，以确保研究结果的准确性和可靠性。
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